فرهنگ و تاريخ | سرگرمي | نيازمنديها | مذهبي | اقتصادي | خانواده و اجتماع | هنر | اخبار | ورزش | کامپيوتر | گردشگري | صنعت و دانشگاه | صفحه اصلي

صفحه اول بخش پزشکي
دانشگاه ها و اساتيد پزشکي
آموزش علوم رشته پزشکي
نرم افزارهاي رشته پزشکي
مراکز تحقيقاتي پزشکي
پروژه تحقيقاتي بخش پزشکي
رده بندي سايتهاي پزشکي
متخصصين رشته پزشکي
بانک مقالات رشته پزشکي
پايان نامه هاي دانشجويي
مجلات و نشريات پزشکي
گالري عکس بخش پزشکي
 
 

عنوان: واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR)
نويسنده: مهرداد آرايي نژاد                 ايميل: mehrdadaraii@yahoo.com

منبع اطلاعاتي: www.olom88.blogfa.com  post-13            تاريخ نگارش: 09/01/1389

عکس

 

 

گالري تصاوير

 

- - - -

   
 
 

واکنش زنجيره اي پليمراز  (PCR) يا (Polymerase Chain Reaction) تکنيکي است که به طور گسترده اي در بيولوژي مولکولي به کار برده مي شود. اين تکنيک نام خود را از يکي از ترکيبات کليدي خود، DNA پليمراز ، که جهت تهيه تعداد بسيار زيادي از کپي از يک رشته DNA مورد نظر بکار گرفته مي شود؛ مي گيرد. با ادامه روند PCR از تعداد کپي هاي اوليه يک قطعه DNA، که ممکن است يک يا تعداد بسيار کمي باشند، به عنوان الگو استفاده شده و به ميزان بسيار زيادي در حد چندين ميليون کپي توليد مي گردد. که محصول نهايي PCR را به طور کلي آمپليکون (Amplicon) گويند. که به معني ماده تقويت شده يا آمپلي فايد شده است.
 


تقريبا تمام DNA پليمراز مقاوم به حرارت را جهت انجام پليمريزاسيون به کار مي گيرند که يکي از مهمترين آنها آنزيم Taq DNA Polymerase که از باکتري Thermus aquaticusکه در چشمه هاي آبگرم جوشان زندگي مي کنند بدست مي ايد. اين آنزيم نوکلئوتيدهاي مختلف را مطابق با تريب الگوي DNA اوليه در کنار هم قرار مي دهد تا رشته جديد بوجود ايد. البته همانطور که مي دانيد جهت آغاز فعاليت هر DNA پليمراز نياز به يک رشته اوليه و آغاز گر بخصوصي است که در ابتدا طراحي کرده و در لوله آزمايشي که قرار است اين واکنشها صورت بگيرد رار داده مي شوند که به اين عمل طراحي پرايمر گفته مي شود. اکثريت روشهاي PCR از چرخه هاي حرارتي (Thermal Cycling) استفاده مي کنند که شامل درجه حرارتهاي مختلفي است که در هر چرخه تکرار جهت انجام اعمال خاصي که در ادامه اشاره خواهد شد؛ مي شوند که بطور کلي هر چرخه کامل حرارتي را که زمانهاي مشخصي نيز دارند را يک سيکل گويند ( Cycle) گويند. بطور معمول هر عمل PCR به حدود 40-20 سيکل نياز دارد. بطور کلي اين چرخه ها جهت جدا شدن دورشته DNA از همديگر، اتصال پليمراز و انجام عمل آن و ... است. اختصاصيت عمل PCR به پرايمر بستگي دارد.

◄   تاريخچه:
اين تکنيک در سال 1984 توسط کاري موليس (Kary Mullis) معرفي شده و بطور سريعي در اکثر آزمايشگاههاي جهان جهت اهداف مختلف بکار گرفته مي شود. که برخي از آنها عبارتند از: کلونينگ DNA براي تعيين توالي (Sequencing)، فيلوژني بر پايه DNA، بررسيهاي عملکردي ژنها، تشخيص هاي ارثي ، شناسايي و انگشت نگاري ژنتيکي و رديابي و تشخيص بيماريهاي عفوني. در سال 1993 موليس بخاطر ابداع اين روش، جايزه نوبل را دريافت نمود.

◄   اساس و روش کار PCR
PCR جهت تقويت ناحيه و يا قطعه خاصي از DNA (DNAهدف) بکار گرفته مي شود. که مي تواند يک ژن واحد، قسمتي از ژن يا توالي غير کد کننده باشد. اکثر روشهاي PCR بطور تيپيک قطعاتي با اندازه حدود 10Kbp را تقويت مي کنند ولي در برخي روشها تا Kbp40 نيز قابل انجام است، با توجه به اينکه افزايش طول DNA خطر شکستن آن را در حين حملو نقل يا انجام آزمايش افزايش مي دهد، افزايش طول قطعه DNA نياز به رعايت و انجام اعمال اضافي دارد.

يک سيستم PCR بطور اوليه شامل چندين ترکيب و مواد دارد که عبارتند از:

1- DNA الگو که قصد تقويت آن است.

2- دوقطعه پرايمر که به دوسر 3 يا 5 متصل مي گردد که اين اتصال وابسته به نوع پرايمر و پليمراز است که به سر 3 متصل شود يا 5

3- Taq پليمراز يا هر پليمراز ديگري که درجه حرارت اپتيمم فعاليت آن در حدود 70 درجه باشد.

4- دزوکسي نوکلئوتيدهاي سه فسفاته (dNTP) که اجزاء سازنده DNA هستند.

5- محلول بافر که محيط مناسبي را جهت فعاليت و پايداري پليمراز و خود DNA فراهم مي آورد.

6- کاتيونهاي دو ظرفيتي مانند Mg++، Mn++ ، بطور معمول از Mg++ استفاده مي شود زيرا افزايش ميزان Mn++ با افزايش ميزان موتاسيون در نتيجه ايجاد خطا در قرار دادن نوکلئوتيدها توسط پليمراز، همراه بوده است.

کل عمل PCR در ميکروتيوبهاي 200-10 ميکروليتري صورت مي پذيرد. دستگاههايي را که عمل ايجاد سيکلهاي حرارتي را انجام مي دهند و در واقع نقش اصلي آن ايجاد سيکلهاي حرارتي با زمانهاي مشخص قابل برنامه ريز و تعداد مشخص را دارند را ترمال سايکلر (Thermal Cycler) گويند. اکثر اين دستگاههاي نوين از اثر پلتير (Peltier Effect) جهت سرد و گرم کردن متوالي ميکروتيوبها ، استفاده مي کنند. اين روش با استفاده از صفحات بخصوصي صورت مي گرد که با تغيير جهت جريان سرد يا گرم مي شوند.

◄   نحوه عمل PCR
همانطور که گفته شد هر PCR شامل 40-20 چرخه حرارتي است که سيکل معروفند. اين چرخه ها نيز بطور معمول داراي 3-2 درجه حرارت مشخص است. که معمولا از سيکل هاي حرارتي سه مرحله اي استفاده مي کنند(شکل...). البته ممکن است اين سيکلها با يک درجه حراتي که معمولا بالاي 90 درجه است جهت آماده سازي و يا در آخر عمل جهت استخراج محصولات نيز همراه باشد که که به آن Hold گويند. درجه حرارتهايي که استفاده مي شوند و مدت زمانهايي که رعايت مي گردند به عوامل متعددي از قبيل نوع آنزيم مورد استفاده، غلظت يونهاي دوظرفيتي و دزوکسي نوکلئوتيدها و درجه حرارت ذوب شدن پرايمرها بستگي دارد.

بطور کلي مراحل PCR با توجه به شکل به صورت زير است:

1- مرحله آغاز (Initialization step): اين مرحله شامل گرم کردن مواد به درماي حدود 96-94 (يا 98 درجه زماني که از پليمراز فوق العاده مقاوم به حرارت استفاده مي شود) است که معمولا 9-1 دقيقه بطول مي انجامد. البته اينه مرحله در مواردي بکار مي رود که پليمراز مورد استفاده جهت انجام فعاليت نيازبه گرم شدن دارد که به Hot- start PCR معروف است.

2- مرحله دناتوراسيون( Denaturation Step): اين مرحله اولين مرحله معمول PCR بوده و شامل گرم کردن محيط به ميزان 98-94 درجه به مدت 30-20 ثانيه است. اين عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همديگر) هم DNA الگو و هم DNA پرايمر از طريق از بين رفتن باندهاي هيدروژني بين نوکلئوتيدهاي دورشته DNA و توليد DNA تک رشته اي است.

 

3- مرحله اتصال (Annealing step): در اين مرحله درماي واکنش به 65-50 درجه به مدت 40-20 ثانيه کاهش مي يابد تا امکان اتصال DNA پليمراز و پرايمر به DNAالگو که حالا تک رشته اي است فراهم آورد. بطور تيپيک درجه حرارت اتصل حدود 5-3 درجه کمتر درجه حرارت ذوب شدن پرايمر انتخاب مي شود. مناسب ترين اتصال DNA-DNA بين رشته الگو و پرايمر زماني ايجاد مي گردد که هر دورشته در فاصله نزديکي از هم قرار گيرند و هرچه توالي پرايمر با توالي رشته الگوي متناسب تر باشد اين اتصال قوي تر بوده و اتصال قوي جهت انجام عمل پليمراز مورد نياز است.

4- مرحله گسترش يا طويل شدن (Extension/Elongation step): درجه حرارت اين مرحله به آنزيم پليمراز مورد استفاده و درجه حرارت اپتيمم مورد نياز براي آن بستگي دارد. بطور مثال آنزيم Taqپليمراز در درجه حرارت 80-75 درجه سانتيگراد فعاليت قابل قبول داشته ولي بطور معمول از درجه حرارت 72 درجه سانتيگراد براي اين آنزيم استفاده مي شود. در اين مرحله پليمراز نوکلئوتيدهاي مکمل را بر اساس رشته الگو از 5-3 در کنار هم قرار داده و در نهايت رشته مکمل رشته الگوي اوليه را توليد مي کند. مدت زمان اين مرحله به پليمراز و طول رشته DNA الگو بستگي دارد. به عنوان يک قانون در درجه حرارت اپتيمم پليمراز بايستي 1000 نوکلئوتيد در دقيقه را پليمريزه نمايد. در شرايط مساعد براي مثال اگر محدوديت سوبسترا وجود نداشته باشد در هر مرحله گسترش DNA دوبرابر مي شود.

5- طويل شدن نهايي( Final Elongation): اين مرحله فقط يکبار و پس از آخرين سيکل PCR و در دماي 74-70 درجه بمدت 15-5 دقيقه صورت ميگيرد جهت اطمينان از تبديل کليه DNAهاي تک رشته اي به دورشته اي انجام مي گيرد.

6- مرحله نهايي (Final Hold): اين مرحله در 15-4 درجه سانتيگراد جهت نگه داري کوتاه مدت محصولات واکنش تا زمان استخراج انجام مي گيرد.

جهت اطمينان از اينکه محصول PCR همان توالي مد نظر بوده از الکتروفورز برروي ژل استفاده مي شود. در اين روش جهت مشخص کردن قطعه DNA با وزن مولکولي مشخص و مورد نظر از DNA Ladder استفاده مي شود و قطعه مورد نظر در الکتروفورز از روي اندازه مولکولي استاندارد و کنترل مثبت مشخص مي گردد.

◄   کاربرد هاي مهم PCR

      
●   جداسازي DNA ژنومي

      
●   تقويت و بررسيهاي کمّي DNA

      
●   در تشخيص بيماريها

      
●   که شامل بررسي بيماريهاي بدخيم و سرطانها و بيماريهاي عفوني است.

◄   انواع تکنيکهاي PCR
اين تکنيکها از طريق ايجاد تغييرات مختصري در تکنيک PCR اوليه براي مثال ايجاد تغييرات در نحوه بکارگيري پرايمرها و... ايجاد و ابداع شده و جهت اهداف خاصي برنامه ريزي و اختصاصي شده اند. اين روشها شامل:

 


1- Allele-specific PCR
2- Assembly PCR يا PCA (Polymerase Cycling Assembly)
3- PCR نامتقارن (Asymetric PCR)
4- Helicase- Dependent amplification
5- Hot-start PCR
6- Inter sequence specific PCR (ISSR)
7- Inverse PCR
8- Ligation-mediated PCR
9- Methylation- specific PCR (MSP)
10- MiniPrimer PCR
11- Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification (MLPA)
12- Multiplex PCR
13- Nasted PCR
14- Overlap Extension PCR
15- Quantitative PCR (Q-PCR)
16- Reverse Transcription PCR
17- Solid Phase PCR
18- Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL PCR)
19- Touch Down PCR
20- PAN-AC
21- Universal Fast Walking
 

 

 

 

 

گروه علمي فدک

کليه مطالب ارسالي با نام اشخاص و ذکر منبع در اين سايت درج مي شود

راهنما  |  آمار سايت  |  درباره ما  |  تماس با ما  |  نظر خواهي  | آرشيو  |  عضويت در سايت